导读

• iTRAQ/TMT定量蛋白组学技术

• iTRAQ/TMT标签分子组成

• iTRAQ/TMT技术原理

一、iTRAQ和TMT标签介绍

说到iTRAQ和TMT很多人可能会以为这是两中不同的定量组学技术，但其实呢，iTRAQ和TMT技术只是生产商不同，除了标记规格和标签分子结构有些许差异，标记肽段的原理基本上是一样的。其中iTRAQ由AB SCIEX所开发，紧接着Thermo Fisher研发了TMT，二者只是专利不同，但是使用原理基本一致。

iTRAQ：Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation

TMT：Tandem Mass Tag

iTRAQ-TMT标签结构以及相对定量原理详解－百泰派克生物科技

iTRAQ和TMT标记实质上就是一种化学体外标记试剂，能够特异性标记蛋白质酶解产生的多肽。iTRAQ和TMT标记的蛋白样品规格不同，相比之下TMT能够标记更广泛的样品数，能够同时定量分析多组蛋白样品，少至2个蛋白样品，多至10个蛋白样品，TMT蛋白定量都能够做到。通过标记多组不同样品，TMT和iTRAQ能够同时比对正常组织样品和肿瘤组织样品的蛋白水平差异，以及精准检测肿瘤在发展的不同阶段的蛋白水平变化。

虽然iTRAQ和TMT的标记原理一样，但是两种标签的结构却有一些差异，接下来我们来看看ITRAQ和TMT的标签结构一个各自的细微差异吧

二、iTRAQ与TMT的分子结构比较

iTRAQ与TMT的分子结构比较

从上图来说，我们可以看到iTRAQ和TMT标签在结构上有着明显的差异，但是也有着一些共同点，首先两个标签都由报告基团，平衡基团以及肽反应基团组成，两个标签的各自报告基团和平衡基团的总重都是一定的。另外，两个标签的肽反应基结构也是一样的。iTRAQ和TMT标签的差异在于平衡基团的结构，从下图可以看到TMT的平衡基团结构比iTRAQ标签的更为复杂。iTRAQ标签的平衡基团只有几十Da，而TMT的平衡基团接近200Da，这也是造成iTRAQ和TMT标签质量差异的原因。

简单介绍完两个标签的结构后，我们再以iTRAQ 4-plex标签为例，详细认识一下iTRAQ分子标签的结构组成

三、iTRAQ分子结构组成

iTRAQ 4-plex标签结构

iTRAQ标签分子骨架由三部分核心组件构成：报告基团，平衡基团和肽反应基团。其中，报告基团和平衡基团构成等基团。不同的iTRAQ标签的报告基团的重量不同，4-plex标签的报告基团重量分别是：114，115，116，117Da；平衡基团的质量分别是：31，30，29，28Da，使得4个iTRAQ标签的报告基团总重都是145Da。另外一个核心组件就是肽反应基团，其主要的功能就是与多肽游离的N端氨基发生置换反应，使同位素标签共价交连到肽段N端。 前面说到标签报告基团和平衡基团的质量，很多人可能会好奇，标签的报告基团仅仅相差几个Da，这是如何做到的呢？其实这就是利用了同位素标记的原理。下面我们以iTRAQ标签为例进行解释。

如下图，质量为114的报告基团包含1个C13，报告基团质量增加1Da。同时平衡基团包含1个C13和1个O18，质量总共增加3Da，因此，114标签的总质量增加4Da。以此类推，115的报告基团增加2Da，平衡基团增加2Da；116的报告基团增加3Da，平衡基团增加1Da；117的报告基团增加4Da，平衡基团增加0Da。以上四个标签通过对报告基团和平衡基团进行不同的同位素标记后，各自的报告基团和平衡基团的增加质量不同，但是增加的总的质量是一样的，因此，标签的总重相等。

iTRAQ标签的同位素标记

四、标签与肽段反应的过程

肽段标记反应过程

五、iTRAQ相对定量研究原理

蛋白质首先被裂解为肽段，然后用iTRAQ试剂进行差异标记。由于iTRAQ试剂是等量的，即不同同位素在标记同一多肽后在第一级质谱检测，分子量完全相同，用串联质谱方法对在第一级质谱检测到前体离子进行碰撞诱导解离，产物离子通过第二级质谱进行分析。在二级质谱分析过程中，报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂，质量平衡基团丢失，产生低质荷比(m/z)的报告离子。由于二级质谱可分析相对分子质量相差1的报告基团，不同报告基团离子强度的差异就代表了它所标记的多肽的相对丰度。同时，多肽内的酰胺键断裂，形成一系列 b 离子和 y 离子，得到离子片段的质量数，通过数据库查询和比较，可以鉴定出相应的蛋白质前体。

六、iTRAQ相对定量研究流程

iTRAQ定量分析流程

• 对不同的蛋白质样品进行酶切消化成多肽片段。
• 使用不同的iTRAQ标签对不同蛋白样品消化产生的多肽片段分别进行标记，但是不同的iTRAQ标签的总质量是一样的。
• 比例混合各个标记后的样品。
• 带上标记的多肽片段经过一级质谱分离，在一级质谱中，iTRAQ标签由于总质量数一样，来自不同蛋白样品的相同肽段不能被区分，因此会一起进入二级质谱分析。
• 在二级质谱中，在高能碰撞下iTRAQ的平衡基团会被打碎，因此报告基团得到释放，同时肽段也被释放，碰撞碎裂成二级碎片。这时通过分析肽段的氨基酸序列，可以推测对应的蛋白质的序列；同时各个报告基团的在质谱中的信号强度代表多肽在4组样品中的相对丰度，即反应相应的蛋白质在4组样品中的相对表达水平。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

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3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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